Těšil jsem se, že poprvé uvidím apoptózu naživo

Jak jste se dostal k tématu buněčné smrti?

Téma buněčné smrti mě přitahovalo ještě před mým doktorským studiem. Už v rámci své diplomové práce jsem se věnoval proteinu p53, který s tématem úzce souvisí. Když jsem se rozhodl jít na doktorské studium, můj vedoucí mi přidělil téma nových trendů v detekci apoptózy a autofágie. Ze začátku mě to zaskočilo, věděl jsem, že v této oblasti došlo k prudkému rozvoji různých metod a že i když jsou na kampusu skvělé podmínky, není to srovnatelné s institucemi, kde k těmto přelomovým objevům dochází a které mají v tematice dlouholetou historii. Ale pak jsem měl štěstí. Dozvěděl jsem se o tom, že na Vysokém učení technickém v Brně mají speciální holografický mikroskop, který umí měřit hmotu buněk a je schopen fluorescenčního zobrazování. Jel jsem se na něj podívat, těšil jsem se, že poprvé uvidím apoptózu naživo. Tam jsem také poprvé potkal Anetu Křížovou. Nakonec mě přístroj tak nadchl, že jsme s Anetou začali spolupracovat.

Vaše výzkumná cesta ale nebyla jednoduchá, jak výzkum dál pokračoval?

Výsledky našeho výzkumu jsme představili řediteli firmy TESCAN, která tyto mikroskopy vyrábí. Byl z toho nadšený, protože v té době ještě pořádně nevěděli, k čemu takový mikroskop v biologii používat. Nicméně mikroskop nám tehdy nechtěli dát, takže jsem se asi na tři roky stal jejich zaměstnancem. Jako aplikační specialista jsem jezdil po světě, přednášel a dělal experimenty právě proto, abych demonstroval potenciál kvantitativního zobrazování a pomohl odstranit chyby v softvéru, který k mikroskopu patří. Musím přiznat, že to byla hodně náročná práce. Trvalo mi dlouho dobu, než jsem dokázal nastavit plnohodnotný experiment, který by měl publikovatelné výsledky. Nakonec se to ale povedlo.

Můžete popsat, v čem daný experiment spočíval?

Na svých cestách jsem viděl, jak se jinde ve světě věnují buněčné smrti. Napadlo mě, že při ní buňky ztrácí svoji hmotu, a to jde přece na holografu měřit. Podařilo se to a s pomocí bioinformatika Tomáše Vičara jsme dokázali najít další parametry typické jednak pro lytickou smrt, tedy různé typy nekrózy, tak pro apoptózu, tedy nelytickou smrt. Byli jsme tehdy schopni jenom z mikroskopického záznamu, bez nutnosti jakéhokoliv značení buněk, odlišit tyto dva procesy. To je pomocí molekulárních metod sice možné, ale hodně nepřímé a někdy zavádějící. Naše výsledky jsme publikovali. Nakonec jsme se rozhodli, že ve výzkumu půjdeme ještě dál a zkusíme odlišit další typy nekróz, jako je třeba pyroptóza, nekroptóza nebo feroptóza. To jsou tři typy buněčných smrtí, na které se teď zaměřujeme. Kdyby se nám je podařilo s pomocí naší metody odlišit, tak by bylo možné nejen měřit dynamické parametry celé populace v čase, sledovat rychlost migrace či změny hmotnosti buněk, ale také sledovat viabilitu a zjistit, kolik procent buněk umírá a jakou formou. To by mělo skvělé využití při sledování vlivu různých látek, jako jsou třeba různé nanomateriály nebo jiné experimentální látky, na sledovanou populaci.

Zmiňoval jste různé typy buněčné smrti. Co si pod tím mohu představit?

To je strašně zajímavé téma, o kterém jsme napsali i knížku, která nedávno vyšla. Z vetší části je to zásluha paní doktorky Martiny Raudenské, protože já jsem trochu bordelář a nebyl bych schopný tak konzistentní práce (😊). Nicméně, za posledních třicet let v této oblasti došlo k významným objevům. Byly popsány různé typy programovaných nekróz, jako je pyroptóza, nekroptóza, tedy buněčné smrti, které způsobují v těle zánět. A ten průsak nových informací ze základního výzkumu do výuky a potenciálně i do klinické praxe nebyl tak rychlý, jak by se nám líbilo, proto jsme tu knížku napsali. Chtěli jsme zpřístupnit nové poznatky studentům nejenom medicíny, ale i biologie, i když biologové se do jisté míry o buněčné smrti učí, takže to pro ně není zcela nové téma. Na lékařské fakultě ale tyto poznatky chybí, takže jsme chtěli téma zpropagovat a uvést do všeobecného povědomí. Buněčné smrti se promítají do všech oblastí medicíny od infarktu po rakovinu, kde je to mimořádně důležité. Trápilo mě, že mezi studenty přetrvává řada dogmat, třeba že nekróza je neprogramovaný typ smrti, že autofagie je typ buněčné smrti, že medici neví, jakým typem smrti je indukovaný zánět nebo že pyroptóza je typem smrti, který nastává po infekci buňky patogenem. Takže proto se do této oblasti pouštíme a musím říct, že nás to zatím baví.

Zmiňoval jste ještě jeden pojem, který mě zaujal, a to holografická mikroskopie. Umím si představit, co je to mikroskop, jak pracuje a co v něm vidím, ale co vidím v holografickém mikroskopu?

V podstatě to není o moc jiné než klasický fázový kontrast, který zná každý z laboratoře. Rozdíl je v tom, že s holografickým mikroskopem sleduji hologram, což je vlastně zpoždění fáze světla, které je zpožděné jenom tou buňkou, jejím materiálem, přes který světlo přechází o něco déle než kultivačním médiem. S použitím určitých vzorců a výpočtů jsme schopni vypočítat hmotnost nějaké hypotetické suché buněčné hmoty. Vzhledem k tomu, že u tohoto mikroskopu je velmi dobře kompenzovatelné pozadí, je tato metoda asi nejsnáze přístupná různým automatickým algoritmům zpracování obrazu. Oproti konkurenčním týmům jsme například schopni buňku nebo celou populaci buněk sledovat třeba týden. A za tu dobu vidíme, jak se měnila jejich hmotnost, jak umíraly, jak rychle se pohybovaly.

Znamená to, že člověk při tom vlastně nemusí sedět a dívat se vlastníma očima?

Přesně tak, nemusí. Já do mikroskopu vložím komůrku, kde jsou buňky, a mikroskop to snímá třeba dva dny. Pak si to mohu přehrát v pětiminutovém videu a dostanu podrobnou informaci o tom, co se s těmi buňkami během dvou dnů dělo. Hlavní výhodou však není dlouhodobé snímání zorného pole, ale kvantifikovatelnost naměřených parametrů.

Váš nejnovější projekt je zaměřen právě na vývoj metody založené na holografické mikroskopii. Můžete mi vysvětlit co je její principem?

Pointa je zachytit dynamiku buněčných smrtí pomocí různých fyzikálních parametrů získaných kvantitativním fázovým zobrazováním, kam patří i holografická mikroskopie. Následně výsledky podrobíme metodám hlubokého učení, protože samotná hmotnost buněk nestačí k tomu, abychom odlišili jednotlivé typy smrtí. Apoptóza i nekróza jsou i na úrovni stejné buněčné linie, tedy buněk stejného typu, natolik heterogenní, že pouze na základě hmotnosti je neodliším. Relativně dobře dokážu zjistit, že buňky umírají, ale abych odlišil i typ smrti jednotlivých buněk, na to musím zapojit i jiné parametry.

Chápu to správně tak, že výsledkem by měl být program, který si pak budu moci stáhnout a pokud budu mít holografický mikroskop, budu moci sledovat, co se děje s mou buněčnou linií?

Pokud všechno půjde hladce, tak ano. Ale jsou to biologické systémy, a to je potřeba mít na paměti. Teď třeba zápasíme s tím, že se snažíme indukovat feroptózu a je s tím docela problém, protože když tam nalijeme železo, které feroptózu spouští, tak u našich buněk to nestačí, když tam nalijeme jiné specifické induktory, tak to pořád nestačí a zároveň to nemůžeme dělat jenom na jedné linii, což znamená, že i když se to u jedné linie povede, u jiné nemusí, protože je jinak citlivá na dané induktory.

Máte za sebou proces přípravy žádosti o podporu dílčího projektu Proof of Concept v rámci jedné z interních výzev Masarykovy univerzity, které vyhlašuje a financuje Centrum pro transfer technologií z programu TAČR GAMA 2. Jak tu přípravu hodnotíte ve srovnání s jinými granty?

Z hlediska toho, že tu problematiku řeším v podstatě celou svou dosavadní kariéru, nemám problémy s teoretickou přípravou. Není to první grant, který jsem na tuto tematiku podával, což dost usnadňuje formulaci hypotéz a cílů. Velká pomoc se nám ale dostala od paní Karolíny Kašparové z Oddělení pro vědu a kvalitu LF MU. Její pomoc byla klíčová a nejsem si jist, jestli bych bez konzultací s ní byl schopen potřebné podklady připravit včas.

Vaše projektová žádost byla přijata k podpoře. Jelikož se jedná o takové grantové schéma, ve kterém se očekává interakce s komerčním partnerem, máte představu, jaké firmy by se mohly o výsledky projektu zajímat?

Mohla by to být například společnost TELIGHT Brno s.r.o., která se na rozdíl od mateřské firmy TESCAN nezabývá elektronovými mikroskopy, ale pouze světelnou mikroskopií, například superrezolučními a holografickými mikroskopy.

DĚKUJEME ZA ROZHOVOR.

Více o projektu Masarykovy univerzity, který byl podpořen z programu TA ČR GAMA 2

Celouniverzitní projekt v rámci programu TA ČR GAMA 2 s názvem „Posílení systému komercializace výsledků VaV na Masarykově univerzitě“ administruje Centrum pro transfer technologií MU. Cílem Proof of Concept projektů je zhodnotit a ověřit aplikační potenciál dosažených výsledků výzkumu a vývoje na MU pomocí tzv. dílčích projektů, které jsou vybírány k podpoře na základě interní evaluace a realizovány na jednotlivých pracovištích MU. O udělení projektů rozhoduje Rada pro TT a komercializaci, která je poradním orgánem rektora a jejímiž členy jsou také experti z aplikační sféry. Více viz web.